Die kohärente Raman-Mikroskopie könnte durch die Fusion von Instrumenten und Computern erweitert werden

20. März 2023

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von Light Publishing Center, Changchun Institut für Optik, Feinmechanik und Physik, CAS

Raman-Streuung ist ein inelastischer Streuprozess, der Energien zwischen Photonen und Molekülen austauscht, um Informationen über molekulare Schwingungen zu übertragen. Die Raman-Mikrospektroskopie ist zu einem unverzichtbaren Analysewerkzeug in der Biologie und medizinischen Chirurgie geworden, vor allem aufgrund ihrer beiden „Freiheiten“: markierungsfrei und wasserhintergrundfrei.

Diese Vorteile ermöglichen es uns, lebende Proben ohne endogene Störungen zu untersuchen. Darüber hinaus haben Raman-Peaks eine viel schmalere spektrale Bandbreite als das Emissionsspektrum fluoreszierender Farbstoffe, was die gleichzeitige Untersuchung verschiedener Stoffwechselarten in derselben Umgebung ermöglicht.

In einem neuen, in eLight veröffentlichten Artikel untersuchten Dr. Haonan Lin und Professor Ji-Xin Cheng von der Boston University die Kombination von Instrumentierung und rechnerischen Ansätzen zur kohärenten Raman-Streuung (CRS).

Trotz ihrer erheblichen Vorteile liegt ein grundlegender Nachteil der Raman-Streuung in ihren stark begrenzten Wirkungsquerschnitten. Ein typischer Raman-Querschnitt beträgt 10–30 cm2 pro Molekül, was zu einer sehr langen Signalintegrationszeit von Sekunden bis Minuten pro Brennpunkt führt. Aufgrund dieser begrenzten Geschwindigkeit ist es unpraktisch, dynamische Systeme pixelweise abzubilden. Ein nichtlinearer optischer Prozess wurde eingeführt, um die Raman-Signale kohärent zu verstärken und die grundlegenden Querschnittsgrenzen zu durchbrechen.

Mit zwei synchronisierten ultraschnellen Lasern entstanden kohärente Raman-Signale in kohärenter Anti-Stokes-Raman-Streuung (CARS) und stimulierter Raman-Streuung (SRS). Bei der CRS interagieren zwei Laserfelder synchron mit dem Zielmolekül. Wenn die Schwebungsfrequenz mit dem Raman-Schwingungsmodus übereinstimmt, findet ein kohärent verstärkter Energieübertragungsprozess statt. Es vernichtet das Pumpphoton, wandelt es in den Stokes-Strahl um und erzeugt Photonen mit einer neuen Frequenz.

CRS hat eine chemische Hochgeschwindigkeitsbildgebung basierend auf intrinsischen Raman-Peaks in biologischen Proben ermöglicht. Biologische Proben sind jedoch hochentwickelte Mikrosysteme, die aus verschiedenen Metaboliten bestehen, die häufig spektrale Überlappungen aufweisen, insbesondere im starken, aber überfüllten Kohlenstoff-Wasserstoff-Bereich (CH).

Es behindert die Quantifizierung und Identifizierung von Chemikalien in Zellen und Geweben mithilfe von Schmalband-Einfarb-CRS. In den letzten Jahren wurden erhebliche Anstrengungen unternommen, um ein hyperspektrales CRS zu entwickeln, das an jedem Pixel ein Raman-Spektrum erzeugt.

Hyperspektrale Bilder bieten die Möglichkeit, Informationen über chemische Zusammensetzungen und Häufigkeit in einer komplexen Umgebung zu entschlüsseln. Aufgrund der hohen Dimensionalität des Rohbildes sind solche Informationen jedoch nicht ohne weiteres verfügbar. Zur Identifizierung der wichtigsten reinen Komponenten und zur Zerlegung von Konzentrationskarten sind Algorithmen erforderlich.

Parallel zu den Instrumentenentwicklungen im hyperspektralen CRS wurde über verschiedene Methoden zur Entmischung hyperspektraler Bilder berichtet. Abhängig davon, ob Vorinformationen über die Zusammensetzung reiner Komponenten vorliegen, kategorisieren wir diese entweder in überwachte oder unüberwachte Methoden.

Instrumentelle Innovationen haben die CRS-Bildgebung auf eine Geschwindigkeit von bis zu 2 kHz Bildfrequenz, eine spektrale Abdeckung von bis zu 3500 cm-1 und eine spektrale Erfassungsgeschwindigkeit von bis zu 5 µs pro Spektrum gebracht. Diese Bedingungen können jedoch aufgrund der physikalischen Grenze, die durch die Empfindlichkeitsgrenze von CRS bestimmt wird, nicht gleichzeitig erfüllt werden.

Beispielsweise verschlechtert eine weitere Erhöhung der Geschwindigkeit das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) des Aufbaus und macht ihn für biomedizinische Anwendungen unbrauchbar. Unter der Bedingung des Lichtschadens kann dieser Kompromiss als Gestaltungsspielraum vermittelt werden. Es handelt sich um eine Hyperebene, die sich mit drei Achsen schneidet, die Geschwindigkeit, spektrale Bandbreite und SNR darstellen. Die Optimierung der Instrumentierung ermöglicht es dem System, einen optimalen Zustandspunkt auf der Hyperebene zu erreichen, doch es bleibt eine Herausforderung, darüber hinauszugehen.

Das Forschungsteam stellte verschiedene Rechenmethoden vor, mit denen die Grenzen der chemischen CRS-Mikroskopie erweitert werden sollen. Um Fehlinterpretationen der Messungen zu vermeiden, muss auf den anwendbaren Umfang der Rechenalgorithmen geachtet werden. Entscheidend ist die Beurteilung, ob das Vorwärtsmodell den zugrunde liegenden physikalischen Prozess angemessen beschreiben kann. Dazu gehören die statistische Verteilung des Messrauschens, der Bildfaltungskern des Bildgebungssystems und andere Techniken.

Zur Charakterisierung des Vorwärtsmodells und zur Kalibrierung der Modellparameter sollten strenge Experimente durchgeführt werden. Wenn frühere Modelle/Regularisierungen verwendet werden, ist ein umfassendes Verständnis des Signals erforderlich. Die Optimierung der Hyperparameter für frühere Modelle ist für die Erzielung korrekter Ergebnisse von entscheidender Bedeutung und erfordert möglicherweise iterative Aktualisierungen und Validierungen.

Für Deep-Learning-Anwendungen wird zwar die Aufgabe einer anspruchsvollen Modellierung des inversen Problems erleichtert, es sind jedoch eine geeignete Auswahl von Netzwerkstrukturen und ausreichend große Trainings- und Validierungsdatensätze erforderlich.

Mit Blick auf die Zukunft geht das Forschungsteam davon aus, dass Fortschritte bei der Instrumentierung den Datendurchsatz in zeitlichen, räumlichen und spektralen Dimensionen weiter steigern werden. Sie sollten mehr Funktionen für Datenstrukturen bereitstellen, z. B. Sparsität und Korrelation. In der Zwischenzeit können neue Berechnungsmethoden genutzt werden, um die Kompromisse beim Designraum zu überwinden und angereicherte chemische Zusammensetzungen für die biomedizinische Forschung bereitzustellen. Angesichts der rasanten Fortschritte in der computergestützten optischen Mikroskopie erwarten wir, dass weitere Ideen in CRS eindringen.

Da sich die meisten Berechnungsmethoden auf Weitfeld-Implementierungen konzentrieren, ist die Umsetzung in die CRS-Mikroskopie nicht trivial. Umfangreiche Modellierung, Systemdesign und Algorithmenentwicklung müssen durchgeführt werden, um die Anwendbarkeit auf die CRS-Bildgebung sicherzustellen. In Zukunft werden rechnerische Methoden eine noch wichtigere Rolle spielen, da bestehende Methoden weiterhin brauchbar bleiben, um den neu geschaffenen Designraum zu erweitern. Es könnten neue Methoden entstehen, um Durchbrüche in Aspekten wie Sichtfeld, Bildtiefe und räumlicher Auflösung zu erzielen.

Mehr Informationen: Haonan Lin et al., Computergestützte kohärente Raman-Streubildgebung: Überwindung physikalischer Barrieren durch die Fusion fortschrittlicher Instrumentierung und Datenwissenschaft, eLight (2023). DOI: 10.1186/s43593-022-00038-8

Bereitgestellt vom Light Publishing Center, Changchun Institute of Optics, Fine Mechanics And Physics, CAS